Southern blotting
Southern blotting bruges til at søge efter tilstedeværelsen af en specifik DNA-sekvens i en DNA-prøve.
Forudsætter: Gelelektroforese (af DNA) og evt. restriktionsskæring.
Southern blotting er en teknik til at bestemme om en specifik DNA-sekvens er til stede i en prøve. Metoden er derfor bl.a. egnet til at kontrollere, at man har skabt den rigtige DNA-sekvens, eller at en gensplejset organisme rent faktisk også er gensplejset.
Princippet i Southern blotting består i at lave en kunstig, enkeltstrenget DNA-streng (probe) med den nøjagtige sekvens, man ønsker at søge for. Proben vil nu kunne binde til DNA-prøven ved komplementær baseparring, hvis prøven netop indeholder den søgte sekvens. DNA-proben mærkes radioaktivt, så dens binding til prøven vil kunne kendes.
Sådan bruges Southern blotting
DNA-prøven skæres først i tilfældige, mindre stykker ved brug af et restriktionsenzym. Herved er det muligt at få spredt den ud efter længde ved hjælp af gelelektroforese (figur 37). Prøven denatureres nu med varme, så hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge brydes, og de deles i enkeltstrenget DNA. De længdeadskilte DNA-stykker, der måske et sted indeholder den prøve, der søges for, overføres nu til en membranplade, der fastholder de forskellige DNA-længder i deres position.
Figur 37. Southern blotting. DNA’et skæres først i mindre stykker med et restriktionsenzym, og de forskellige længder adskilles med gelelektroforese. DNA’et overføres til en membranplade. Hvis en radioaktiv probe (grøn) kan binde, afslører det, at den søgte sekvens var til stede.
Når proben nu tilsættes, vil den kunne binde ved baseparring til eventuelt identiske sekvenser i DNA-prøven, da de begge er enkeltstrengede, og DNA som bekendt gerne vil være dobbeltstrenget. På den måde får man en binding af proben, hvis den søgte DNA-sekvens er til stede i prøven. Det kan til sidst afsløres ved at vaske ubundet probe af og tage et røntgenfoto af prøven, fordi proben vil blive siddende på membranen de steder, den har bundet til en identisk sekvens. At sekvensen var til stede i DNA-prøven, er hermed vist.Længden af prober, der søges med, er gerne mellem 100 og 1.000 nukleotider, og den radioaktive mærkning kan foregå ved at have en phosphor-32 isotop i stedet for normalt phosphor i nukleotidernes phosphat-grupper.
Eksempel på brug af teknikken:
Southern blotting blev anvendt af forskere i udviklingen af en medicinproducerende, transgen ged som du kan læse mere om på projektets hovedside.
