DNA restriktionskæring og ligering
En af de vigtigste opdagelser indenfor genteknologien var den række af enzymer, der klipper DNA over helt bestemte steder.
Restriktionsenzymer (eller restriktions-endonukleaser) findes i hundredvis af varianter, der hver skærer DNA-strenge over ved en bestemt sekvens som typisk er 4-8 nukleotider lang, fx AGATCT.
Figur 34. Restriktionsskæring med enzymet EcoRI giver sticky ends.
Restriktionsenzymerne var et guldfund for forskerne pga. muligheden for at skære DNA over ved en præcis sekvens. Denne præcise skæring af DNA kan bruges sammen med sammenklæbningsenzymet DNA-ligase til populært sagt at klippe og klistre DNA og dermed gener sammen. Kendskabet til disse enzymer betød gensplejsningens fødsel og gjorde det bl.a. muligt at producere de første rekombinante proteiner.
Restriktionsenzymerne virker ved at skære det dobbeltstrengede DNA over, typisk skråt, så der skabes enkeltstrengede ender (sticky ends) (se figur 34). Sticky ends har som navnet antyder en slags klistrende evne, da de komplementære, enkeltstrengede ender gerne vil finde tilbage til hinanden og genetablere deres indbyrdes tiltrækkende hydrogenbindinger ved almindelig baseparring. Denne tiltrækning eksisterer naturligvis ikke for de lige skårne blunt ends, så det kan være svært at vide, hvordan de sad sammen før skæring.
Den sekvens, som restriktionsenzymerne genkender, er ofte palindromisk. Det vil sige, at sekvensen ved skæringsstedet er ens på begge strenge blot set fra hver sin retning (se eksempel på palindromisk skæring i figur 34).
Eksempler på brug af restriktionsskæring
Metoden med at ‘klippe/klistre’ med restriktionsenzymer og DNA-ligase kan fx bruges til at sætte en proteinkodende DNA-sekvens (et gen) ind i en ekspressionsvektor, når man skal lave en celle, der producerer et nyt protein. Det kræver simpelthen, at der sidder de samme skæringssekvenser der, hvor den proteinkodende DNA-sekvens og ekspressionsvektoren skal klippes op og sættes sammen.
Restriktionsenzymer anvendes også i mange andre genteknologiske værktøjer. Fx når en hel organismes DNA (genom) skal analyseres med et Southern blot.
