Polymerase chain reaction (PCR)
PCR til at opkopiere bestemte DNA-sekvenser i en prøve er nu en af genteknologiens absolut vigtigste værktøjer.
PCR (Polymerase Chain Reaction) er en af de mest udbredte molekylærbiologiske teknikker i dag og er helt uundværlig i mange situationer. PCR udnytter et af naturens egne enzymer, DNA-polymerase, til at opkopiere en bestemt DNA-sekvens i en række gentagne cyklusser. Med PCR er det altså nemt og hurtigt at skabe millioner af kopier af så lidt som én DNA-streng, fx fundet på en mulig forbryder til brug i retsmedicin.
Ideen med PCR er som nævnt at foretage et antal gentagne cyklusser, hvor en udvalgt DNA-sekvens kopieres i hver cyklus og derved principielt fordobles i antal for hver gang (en kædereaktion). Ligesom i naturen kan DNA-polymerase kun kopiere DNA, hvis der til rådighed er såkaldte korte primer-sekvenser af komplementær DNA. Primerne binder til DNA’et der, hvor kopieringen skal begynde.
Valg af primere – kopiernes start og stop
DNA har som bekendt to strenge, der løber i hver sin retning (3′ til 5′ og 5′ til 3′). Derfor vil DNA-polymerase i PCR også kopiere de to strenge i hver sin modsatte retning. Dette indebærer, at der skal bruges to forskellige primere – én til start af kopiering i hver retning. DNA-polymerase bygger nemlig udelukkende en ny streng op i retningen fra 5′ til 3′. Den streng, enzymet bruger som skabelon, skal altså gå modsat, dvs. fra 3′ til 5′ (se figur 32). Det betyder, at de to nødvendige primeres sekvenser skal vælges, så den ene baseparer til startstedet på den ene streng, og så den anden baseparrer til den anden strengs startsted. Da strengene er modsatrettede, ligger det ene startsted automatisk samme sted som stopstedet på den modsatte streng (se figur 32).
Figur 32. Opkopieringen af en specifik DNA-sekvens med PCR ved tilsætning af primere (gul og rød), der binder til startstedet for kopieringen på hver af de to DNA-strenge. Binding af primere afgør altså hvilken DNA-sekvens, der skal opkopieres fra det tilgængelige skabelon-DNA.
Hvorfor startstedet på én streng samtidig er slutstedet på den anden streng, kan være lidt svært at forstå. Men det skyldes, at de DNA-strenge, som dannes i den første cyklus, også vil fungere som skabelon i den næste fordoblingscyklus, men nu for den modsatte streng og retning. Derfor er strengen ikke længere, når DNA-polymerasen kommer frem til det oprindelige startsted – som derfor bliver et stopsted (se figur 32).
Faserne i en PCR-cyklus
Hver cyklus er delt op i tre forskellige faser, der har hver deres temperatur og varighed (se figur 32).
1. Opvarmning (denaturering af DNA)
Det dobbeltstrengede DNA, der skal bruges som skabelon i reaktionen, skal først denatureres ved høj temperatur (ca. 95 oC) nogle sekunder. Dette gør DNA’et enkeltstrenget, så hver streng kan få bygget en ny komplementær streng senere i PCR-cyklussen.
2. Nedkøling (binding af primere til DNA)
Temperaturen sænkes til omkring 60 oC, hvor de tilsatte primere vil kunne binde til startstederne på det enkeltstrengede DNA.
3. Elongering (dannelse af de nye, komplementære DNA-strenge)
Temperaturen hæves til 72 oC, hvor DNA-polymerase binder til primerne ved startstederne og bygger videre på de nye, komplementære DNA-strenge. DNA-polymerasen fortsætter, så længe temperaturen ikke hæves, og så længe der stadig er skabelon-DNA til rådighed. Varigheden af trinnet beregnes derfor, så cyklussen først genstarter, når hele den interessante DNA-sekvens er forlænget (elongeret).
En PCR med 30 cyklusser varer gerne 2-3 timer.
Nytten i at opkopiere DNA: Forskellige roller for PCR
Teknikken med at kunne opkopiere et bestemt område fra ganske lidt skabelon-DNA er meget anvendelig i genteknologien.
Her er to ud af mange anvendelser:
Danne DNA til gensplejsninger
PCR kan bruges i arbejdet med at danne det DNA, der skal indsættes i en organisme, som gensplejses. Ved hjælp af særlige primere kan det desuden lade sig gøre at sætte to stykker DNA sammen fx et protein og grønt fluorescerende protein (GFP). På den måde bliver proteinet selvlysende, og man kan se det inde i cellen. Denne metode til sammensætning af DNA kaldes fusions-PCR og forklares ikke nærmere her.
Diagnostisk PCR
PCR kan bruges til at vurdere, om bestemte mikroorganismer (fx sygdomsfremkaldende bakterier) er til stede. Til DNA’et i prøven tilsættes særlige primere, som ville kunne binde til et område af bakteriens DNA og opkopiere det i PCR. Hvis resultatet viser en opkopiering af DNA af netop den forventede længde, tyder det på, at bakterien var til stede. På samme måde kan det undersøges med PCR, om en gensplejset organisme rent faktisk indeholder det indsatte DNA.
Teknikken bag PCR
PCR’en foregår typisk i en lille blanding på kun 30-70 mikroliter, for her kan stadig være millioner af DNA-kopier.
Det nødvendige temperaturprogram styres fra en lille computer i PCR-maskinen, der konstant regulerer de forskellige temperaturer, som styrer hvilken af de tre faser, der foregår. Den DNA-polymerase, man anvender i PCR, er meget varmestabil, hvilket betyder, at den ikke ødelægges (denaturerer) af de høje temperaturer, som bruges. En PCR-primer har typisk 20 basepar, og de syntetiseres kemisk af firmaer til bestilling på nettet. En sådan primer koster p.t. ca. 20-30 kr.
Figur 33. PCR-rør er kun ca. 2 cm høje, men store nok til at rumme de millioner af kopier af DNA, som bliver dannet under PCR.
