Diagnostik af sygdomme

Denne underside om Diagnostik af sygdomme udgør fjerde del af teorien for Biotech Academys materiale om Genetik.

Genetiske sygdomme er ubehagelige. Der er ikke nogen livsstil, der medfører genetiske sygdomme. Patienterne er født med sygdommen, og en stor del af sygdommene fører til en nedsat, forventet levetid og nedsat livskvalitet.

Forskellige genetiske sygdomme har forskellige symptomer. Nogle genetiske sygdomssymptomer er visuelle, såsom unikke ansigtstræk i patienter med Downs syndrom, mens andre sygdomme ikke har nogle tydelige symptomer før patienten er over 30 år, såsom Huntingtons sygdom. Fælles for alle genetiske sygdomme er dog, at de viser sig som fejl i patientens DNA, og man kan derfor, med de rigtige analyser, finde disse DNA-fejl for at give en diagnose. Alle arvelige sygdomme er genetiske, men det er ikke alle genetiske sygdomme, som er arvelige. Downs syndrom er ikke et resultat af nedarvede fejl, derimod er det en kromosom fordelingsfejl under befrugtningen, der medfører sygdommen. Genetiske sygdomme er en fællesbetegnelse for kromosomfejl såvel som genetiske fejl, og genetiske sygdomme er derfor en bredere betegnelse end arvelige sygdomme.

Ved diagnosticering af genetiske sygdomme skelner man typisk mellem diagnostiske undersøgelser, som har til formål at be- eller afkræfte om en patient har en genetiske sygdom og prædiktive undersøgelser. Prædiktive undersøgelser har til formål at analysere, om en person er prædisponeret til at udvikle en kendt genetisk sygdom. Hvis et par planlægger at blive gravide, kan man også foretage en såkaldt anlægsbærerundersøgelse, hvor forældrenes DNA bliver analyseret for sygdomsfremkaldende mutationer. Hvis man foretager en anlægsbærerundersøgelse, viser den, om man har en muteret allel, som kan gives videre til ens børn.

 

The Human Genome Project og dets indflydelse på genetik

Hvordan kan vi vide, hvordan en vildtype eller en muteret allel ser ud? Svaret er at vi lige siden 2003 har kendt mennesket genom takket være The Human Genome Project (HGP). HGP var et 13årigt projekt, som havde til formål at lave et genetisk kort over alle de menneskelige gener. Vi har derfor lige siden slutningen af HGP kendt alle DNA-positioner i genomet, og vi har derfor en reference at sammenligne med, når vi skal stille diagnoser på simple genetiske sygdomme, der er forårsaget af enkelte eller få fejl i vores DNA-sekvens.

 

Genetiske undersøgelser

Ved diagnostiske undersøgelser kan patienter, der viser symptomer, eller asymptotiske personer blive testet for diverse genetiske sygdomme. Måden testen bliver udført på er ved først at tage nogle celler fra patienten. De bliver typisk taget fra indersiden af kinden eller ved en blodprøve. Cellerne indeholder patientens DNA, og det kan nu undersøges. Der er flere forskellige metoder, som bliver anvendt til at undersøge DNA’en. Den mest normale er en gen-sekvensering (se sektionen med gen-sekvensering). For at lægerne kan lave en gen-sekvensering, skal DNA’en først kopiers, så lægerne har nok DNA at arbejde med. Det bliver gjort med en PCR-test. PCR står for Polymerase Chain Reaction, og er en fundamental metode, som bliver brugt inden for bioteknologi, medicin, biologi, retsmedicin mm. Den benytter et af naturens egne enzymer til at generere mange millioner kopier DNA. Biotech Academy har en artikel omkring PCR her.

Tekstboks 3: Mængden af DNA i mennesker.

Levende organismer har meget DNA. Hvis du lægger alle DNA-strenge fra en enkelt celle i forlængelse af hinanden, har du, som mand, en samlet DNA-streng på 6.270.000.000 bp. Det svarer til en DNA-streng på 205 cm, som vejer 0,00000000000641 g (6.41 pikogram). Kvinders DNA er lidt længere og indeholder 6.370.000.000 bp, med en længde på 208,23 cm og en vægt på 0,00000000000651 g (6.51 pikogram). I 2016 blev det estimeret, at en gennemsnitlig menneskekrop indeholder 3.7 • 1013 celler. Ud af dem er 70% røde blodlegemer, som ikke indeholder DNA. Med den viden kan vi regne os frem til, at DNA’et i en gennemsnitlig mand vejer 71,151 g og 72,261 g i en gennemsnitlig kvinde.

Det er alt sammen sjove fakta, men det er med til at sige, at der er meget DNA og også meget DNA, som ikke er af interesse, når man skal diagnosticere en patient med en genetisk sygdom. Det er estimeret, at 99% af menneskeligt DNA ikke koder for nogle gener. Så 99% af vores DNA er ikke interessant, når læger skal bekræfte tilstedeværelsen af sygdomsfremkaldende gener.

De gener, der er af interesse når læger skal diagnosticere patienter, er fundet vha. HGP og anden forskning. Forskere har fundet frem, til at Huntingtons sygdom er forårsaget af mange ustabile trinukleotid gentagelser på huntingtin genet, der findes på kromosom nr. 4. Cystisk fibrose er oftest forårsaget af en mutation i genet Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) på kromosom nr. 7. CF-mutationen er en sletning af tre nukleobaser i genet, hvilket betyder, at aminosyren, fenylalanin, ikke kommer med i proteinet. Uden fenylalanin kan proteinet ikke folde sig ordentlig, og det fungerer derfor ikke, som det skal.

Viden om disse sygdomsfremkaldende mutationer er vigtigt, når man skal stille en diagnose.

Gensekvensering

Gensekvensering er en nyere diagnosticeringsmetode, som har den fordel, at man kan få den nøjagtige nukleotidsekvens af patientens DNA. Resultatet af en gensekvensering er en såkaldt FASTA-fil. FASTA er et tekstbaseret format, som bliver brugt til at repræsentere nukleotid sekvenser. Nukleotider er byggeblokkende af DNA, og der findes fire forskellige: adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og thymin (T). De fire forskellige nukleotider er repræsenteret af deres forbogstaver, og man kan derfor opsætte en lang bogstavrække, der repræsenterer sekvensen på en DNA-streng.

I praktisk bliver gensekvensering brugt til at stille diagnoser på forskellige genetiske sygdomme. Lægerne, der vil undersøge patienten, kender til positionen på de forskellige sygdomsfremkaldende mutationer. Patientens DNA bliver først opformeret vha. en PCR, inden det bliver analysere. Ved at lave en PCR før analysen sikrer lægerne, at det er det rigtige gen, som bliver analyseret, og at der er nok DNA til at lave analysen.

Der findes mange metoder til at lave gen-sekvensering på. Den ældste og stadig ret populærere metode er den såkaldte sanger sekvensering metode, som kan aflæse DNA-sekvensen af en cirka 1000bp lang streng DNA. Sanger sekvensering bliver beskrevet i tekstboks 4.

Udover sanger sekvensering findes flere former for gensekvensering. Du kan finde en oversigt over de forskellige sekvenseringsmetoder her: https://www.biotechacademy.dk/undervisning/gymnasiale-projekter/moderne-genteknologi/dna-sekventering/.

Tekstboks 4: Sanger sekvensering.

For at udføre en sanger sekvensering, skal man have fire ting:

  • En masse kopier af det DNA, man gerne vil analysere. Kopierne er typisk lavet vha. PCR.
  • Fluorescerende markeret dideoxy-nukleotider (ddNTP)
    • ddNTP er modificerede versioner af deoxy-nukleotider (dNTP). Forskellen mellem ddNTP og dNTP er, at når ddNTP bliver inkorporeret i den groende DNA-kæde, stopper den med at gro. Der er fire forskellige ddNTP, der kan blive inkorporeret i DNA (ddATP, ddGTP, ddTTP og ddCTP), og til sanger sekvensering er de hvert især markeret med forskellige farver fluorescens – på den måde kan man se forskel på dem.
  • En PCR primer, som bestemmer starten af sekvenseringen. Ligesom i PCR bestemmer primeren, hvor på DNA’et sekvenseringen skal starte.
  • En maskine, der kan læse fluorescens.

Der er tre skridt til at udføre en sanger sekvensering:

Første skridt har til formål at generere en masse kopier af DNA’et med forskellige længder. Denne generering fungerer på samme måde som normal PCR (figur 16 (1)). Forskellen mellem PCR og denne metode er, at i reaktionen er der tilføjet en lille mængde ddNTP’er. Fordi PCR-reaktionen slutter når en ddNTP bliver inkorporeret, genererer denne PCR en masse DNA-strenge med forskellige længder (figur 16 (2)). Alle DNA-strengene har en tilfældig længde, men fordi der bliver genereret mange millioner DNA-strenge, vil der blive genereret DNA-strenge med alle længder (Figur 16 (3)).

Næste skridt er at analysere hvilke DNA-strenge vi har. Analysen af DNA-strengene bliver gjort via en specifik form for gel elektroforese, kaldet kapillær gel elektroforese. Kapillær gel elektroforese fungerer efter samme princip som normal gel elektroforese. Prøven bliver tilføjet til en gel, og gelen bliver udsat for et spændingsfelt. Spændingsfeltet sørger for at DNA’en bliver trukket igennem gelen, og størrelsen på DNA-stykkerne bestemmer, hvor på gelen de befinder sig, når man slukker for spændingsfeltet. De længste stykker DNA vil befinde sig i toppen af gelen og de korteste stykker i bunden. Mere om Gelelektroforese her.

Fluorescensen af de forskellige stykker DNA kan derefter blive målt med en laser og en detektor, figur 16 (4). Alt efter DNA’ets positionen på gelen og farven på fluorescensen kan maskinen se, hvilket nukleotid der befinder sig på den tilsvarende position i DNA’et (figur 16 (5)). Resultatet af sekvenseringen kommer i form af en DNA-sekvens i FASTA-format, se figur 16 (5). Diagrammet i figur 16 (5) viser oversigten af hvilke farver, som er detekteret på forskellige dele af gelen, og farverne er så oversat til deres korresponderende ddNTP.

Et eksempel på en DNA-sekvens i FASTA-format:

5’-ATGGTATCAAAAGGAGAAGAGCTATTTACAGGGGTGGTGCCGATTTTGGTCGAACTGGATGGCGACGTGAACGGTCATAAATT

CTCCGTCTCTGGTGAGGGCGAGGGCGACGCGACCTATGGTAAGCTTACCTTAAAGTTCATCTGCACCACGGGTAAGTTGCCTGTG

CCGTGGCCGACCCTGGTGACGACCCTGACGTACGGTGTGCAATGTTTTAGCCGTTATCCGGACCACATGAAACAGCATGATTTCT

TCAAAAGCGCAATGCCAGAAGGCTACGTTCAAGAGCGTACCATCTTTTTCAAGGACGACGGAAACTACAAGACCCGCGCCGAGG

TTAAGTTTGAAGGTGAAAG-3’

Uanset hvilken sekvenseringsmetode der bliver anvendt, ender lægerne med at have patientens DNA- sekvens, som de så kan sammenligne med en standard. Hvis DNA-sekvensen stemmer overens med den raske standard, er patienten ikke disponeret til at få sygdommen. Omvendt hvis patientens DNA-sekvens stemmer overens med standarden for det sygdomsfremkaldende gen, er patienten disponeret til at have sygdommen.

 

Analyse af FASTA-sekvenser og sygdomsfremkaldende mutationer

Ved hjælp af sekvensering kan man skaffe DNA-sekvensen af en syg patient, med det mål at sammenligne den med DNA, der stammer fra en rask person. Ved at sammenligne DNA’en kan man finde uoverensstemmelser i DNA’et. Uoverensstemmelser mellem patientens DNA og ”rask” DNA svarer til steder på DNA’et, hvor patienten har mutationer. Hvis patienten har mutationer de steder, hvor man typisk ser mutationer i andre personer med sygdommen, kan lægerne konkludere, at patienten er disponeret for sygdommen.

I figur 16 er der vist et eksempel på en FASTA-sekvens fra en patient. Vi skal bruge FASTA-sekvensen til at diagnosticere patienten ved at sammenligne den med FASTA-sekvenser fra en rask og en syg person. Kan du se om patienten er sund eller rask ud fra FASTA-sekvensen?

 

Figur 16: Øvelse – se om patienten har DNA sekvensen for en rask eller syg person.

 

Hvis du kom frem til, at patienten har DNA-sekvensen for en syg person, har du ret! DNA-sekvensen for patienten har nemlig samme sekvensfejl, som den syge patient.

 

Svar på sekvenseringsøvelse

Men hvad er konsekvensen af en ”lille” fejl med ændringen af 2 basepar? Ifølge det centrale dogme bliver DNA transskriberet til mRNA, som bliver translateret til et protein, bestående af aminosyrer. Tre basepar i en DNA-sekvens bestemmer, hvilke aminosyrer der bliver inkorporeret i proteinet. En ”lille” fejl i DNA-sekvensen kan medføre, at den forkerte aminosyre bliver inkorporeret. I eksemplet i figur 16 betyder DNA-fejlen, at aminosyren, valin, bliver indsat i den syge patients protein i stedet for glutaminsyre. Denne udskiftning af aminosyre kan ændre proteinets struktur, eller på anden vis gøre, at proteinet ikke fungerer som det skal.

 

Prædiktive undersøgelser

Prædiktive undersøgelser bliver brugt på personer, som ikke viser symptomer på en genetisk sygdom, men i stedet er i familie med personer, som har en genetisk sygdom. Prædiktive undersøgelser fungerer på samme måde som diagnostiske undersøgelser, og har til formål at be- eller afkræfte, om personen bærer på det sygdomsfremkaldende gen. Sygdomme som der oftest bliver undersøgt for er: Alzheimers, Huntingtons sygdom, Parkinsons sygdom og muskeldystrofi. Sygdommene, der bliver testet for, er oftest dominant autosomalt nedarvet.

Prædiktive gentests har til formål at finde genetiske sygdomme tidligt i patienter. Ved at stille en diagnose tidligt, vil patienten have mulighed for hurtigt at få behandling. I nogle tilfælde kan sygdommen forebygges med medicin, der har til formål at hjælpe patienten til at opnå en længere forventet livstid eller øge patientens livskvalitet. Patienten vil også kunne få information om sygdommen, såsom dødelighed, arvelighed og forventet levetid. Så patienten har mulighed for at lægge realistiske fremtidsplaner.

 

Anlægsbærerundersøgelse

En anden test, som minder om den prædiktive undersøgelse, er en såkaldt anlægsbærerundersøgelse. Anlægsbærerundersøgelse bliver brugt til at undersøge, om personer bærer autosomal recessive sygdomsfremkaldende alleler, såsom Cystisk fibrose, seglcelleanæmi (sygdom som ændrer de røde blodlegemers form) eller spinal muskelatrofi (sygdom i rygmarvens nerveceller). Disse sygdomme er alle autosomale recessive, hvilket vil sige, at personer, som bærer en allel for sygdommen, ikke har sygdommen, men derimod har risiko for at give det sygdomsfremkaldende allel videre til deres børn. Som beskrevet i sektionen om mendelsk nedarvning skal et autosomalt recessivt gen være til stede i begge forældre, før der er risiko for, at deres barn får sygdommen, da barnet skal arve begge recessive alleler, for at blive syg. Anlægsbæreundersøgelsen er smart at tage, hvis man har slægtninge, som har fået påvist den autosomale recessive sygdom. Individer med en ukendt familie disposition (såsom adopterede), kan vælge at tage en anlægsbærerundersøgelse for at undersøge, om der er risiko for, at de er bærere, og dermed kan få et barn med en genetisk sygdom.