Figur 1: Produkter, hvor PFAS typisk har været anvendt. Billeder fra Rainer Stropek, US Army Sourthern Europe, Sara Marlowe, Clean Wal-Mart, Marco Verch og Jarrod Doll alle under licensen CC BY 2.0.

Hvorfor bruges PFAS så meget?

PFAS er smart at bruge i alle disse forskellige produkter, fordi stofferne er både vand- og fedtafvisende. Det kalder man også hydrofobt og lipofobt. Du kan forestille dig, at disse stoffer har en “fobi” for vand og fedt. Det modsatte tilfælde, vand- og fedtelskende, kaldes hydrofilt og lipofilt (måske kender du ordet ”frankofil” for en person der elsker Frankrig). Måske kan du forstille dig, at det er en ret god egenskab at PFAS både er hydro- og lipofobt, hvis du gerne vil lave nogle gode vandafvisende regnjakker eller emballage til dine fedtholdige madvarer som f.eks. pomfritter.

Men hvorfor kaldes PFAS for “evighedskemikaler?” Dette skyldes, at PFAS er meget stabile molekyler, og de er derfor svære at nedbryde, hvilket gør at de er velegnede i mange kemiske miljøer og temperaturer. Molekylets stabilitet skyldes den svært nedbrydelige binding mellem carbon og fluor som kan ses på figur 2.

Figur 2: Et eksempel på et PFAS stof som kaldes PFOA. PFOA består af en kulstofkæde med 8 carbonatomer (C8), hvor brintatomerne er fuldstændigt erstattet med fluoratomer. Kulstofkæden er markeret med gul. Figuren er lavet af Biotech Academy med Biorender.

De særlige kemiske egenskaber er årsagen til, at PFAS har været brugt i så høj grad i perioden 1970 til 1990. Desværre har molekylets stabilitet vist sig også at have nogle konsekvenser.

PFAS i miljøet

Det store forbrug af PFAS og stabiliteten af PFAS har medført, at der i dag kan findes spor af det i naturen. PFAS bliver udvasket til naturen fra ældre lossepladser og anlæg til deponering af byggeaffald. Dermed havner PFAS i f.eks. omkringliggende landbrugsjord, vandløb eller helt nede i grundvandet. Denne udvaskning har vist sig at have vidtrækkende konsekvenser for biologiske organismer. Det skyldes især, at PFAS er bioakkumulerende, hvilket betyder, at det kan ophobe (“akkumulere”) sig i mennesker, dyr og vandorganismer. Samtidig er PFAS også mistænkt for at have skadelige virkninger på biologiske organismer. På figur 3 kan du se de veje der gør at PFAS ender i mennesker. Dette skal du læse mere om i næste afsnit.

Figur 3: Måder, hvorpå vi mennesker kan blive udsat for PFAS

PFAS og mennesker

Vi ved at PFAS er bioakkumulerende. Dette blev opdaget i slutningen af 1990’erne, hvor stofferne blev detekteret i blodplasma fra mennesker. Når man opdager, at et menneskeskabt kemikalie ophober sig i mennesker, er det vigtigt at undersøge effekten af dette. Undersøgelser af PFAS effekt på mennesker mistænker blandt andet stofferne for følgende indvirkninger på mennesker:

• Kræftfremkaldende
• Skadelige for fertiliteten
• Lavere fødselsvægt
• Dårligere immunforsvar
• Hormonforstyrrende

Du kan se flere negative konsekvenser for henholdsvis en mand og kvinde i figur 4.

Figur 4: Negative bivirkninger forårsaget af PFAS.

Måske undrer du dig over, om alle PFAS-stoffer er lige farlige? Det er særligt PFAS-stoffer med længere kulstofkæder (længere end 8 kulstofatomer ”C8”), som har størst tendens til at være bioakkumulerende. Dette er f.eks. PFOS og PFOA. Prøv at tælle hvor mange kulstofatomer der er i PFOA i figur 2. Det hænger sammen med, at kortere kulstofkæder (C4 og C6) er mere vandopløselige. De kortere molekyler kan dermed nemmere bevæge sig gennem kroppen og udskilles gennem urin (fordi dette er vandbaseret). Man har målt halveringstiden (den tid, det tager før, du kun har halvt så meget stof tilbage) for en kortkædet PFAS til 3 dage i mennesker, hvor de tilsvarende halveringstider for PFOS og PFOA er årelange, hhv. 4,8 og 3,5 år. Dette betyder ikke nødvendigvis, at de langkædede forbindelser er mere skadelige end de kortkædede, men du kan forestille dig, at længere ophold i kroppen kan øge risikoen for udviklingen af ovenstående konsekvenser.

Overvågning og regulering af PFAS

Som du kan se, er PFAS til stede både i naturen og mennesker. Hvad gør vi så ved det? I Danmark har Miljøministeriet siden 2014 indskærpet kommunerne, så kontrollen af PFAS i vandforsyninger i særligt udsatte områder øges. Dette er områder, hvor der er en sandsynlighed for, at der kan have været anvendt PFAS. Dette gælder områder i nærheden af brandøvelsespladser, tæppeindustri og malingindustri. Samtidig har Miljøstyrelsen fastlagt nogle grænseværdier for mængden af PFAS, der er tilladt i vores drikkevand. Her skelnes mellem forskellige PFAS, og der er således to forskellige grænseværdier. Fire PFAS-forbindelser er inkluderet i den ene, og denne må ikke overstige 2 nanogram per liter. Den anden indeholder 12 PFAS-forbindelser, og denne må ikke overstige 100 nanogram per liter. Det er godt, at niveauet af PFAS i naturen bliver overvåget, men et andet vigtigt spørgsmål er, hvordan undgår vi udslip af disse stoffer fremover?

Europæisk forbud mod PFAS måske på vej

I starten af 2023 indsendte Tyskland og Holland sammen med Danmark, Norge og Sverige et forslag om et europæisk forbud mod produktion, brug, salg og import af omkring 10.000 forskellige PFAS-forbindelser. Dette forslag skal den Europæiske Kommission officielt fremlægge for medlemsstaterne i 2025, hvorefter en afgørelse er forventet. Går forslaget igennem, forventes det at have stor betydning. På sigt vil sådan en lov reducere PFAS i naturen, gøre de produkter og industrielle processer, som før benyttede PFAS mere sikre for mennesker og skubbe virksomheder til at udvikle nye alternativer til PFAS. Denne regulering gælder kun i EU, men hvis du f.eks. kigger hvor dit outdoor udstyr er lavet, er det sikkert fra Kina eller et andet land i Sydøstasien. Her ville et EU-forbud mod brug af PFAS ikke gælde.

Stadig globalt problem med PFAS

Der gøres generelt en stor indsats for at overvåge og regulere PFAS i Europa, USA og Japan. Desværre er nye aktører, primært i Asien, begyndt at producere langkædede PFAS-stoffer. Opmærksomheden på PFAS i verden er desværre ikke lige så stor som i Danmark. For at kunne takle PFAS-problemet, er det afgørende, at vi handler på et globalt plan. Det betyder, at vi må overvåge og teste for PFAS på verdensplan, så vi kan finde ud af, hvor PFAS-forureningen er mest udbredt og forhindre at PFAS spreder sig mellem lande. Hvorfor måler man mindre på PFAS i Asien?

Det nuværende problem er, at målingsudstyr og ekspertise hovedsageligt findes i ressourcestærke lande i Europa og USA. Det udstyr, der er i stand til at måle PFAS med tilstrækkelig præcision, er dyrt, og det kræver specialiseret viden at bruge. Hvis du har set introvideoen her har du måske en ide om, at det lige netop er dette problem, iGEM-holdet i 2023 prøver på at løse. Du kan læse mere om projektet i næste afsnit.

Må vi præsentere: FluoroLoop!

FluoroLoop er udviklet af DTUs hold til iGEM konkurrencen. FlouroLoop skal gøre det nemmere at måle (”detektere”) et bestemt PFAS. Det er et problem, når viden og ressourcer til detektering og håndtering af PFAS ikke er tilgængelige i alle lande. Hvis et land ikke måler på PFAS kan befolkningen være udsat for PFAS i langt højere grad, end de er vidende om. Dette er faktisk også et problem for de lande, som har adgang til denne viden og disse ressourcer, fordi PFAS ikke er begrænset af landegrænser. For at komme PFAS-forurening til livs, er man derfor nødt til at vide hvor den starter – man må altså starte med at måle. FluoroLoop er en biosensor, som kan hjælpe med at detektere PFAS. Men hvad er en biosensor?

Vi vil ved brug af syntetisk biologi gøre målingen af et bestemt PFAS-stof mere tilgængelig for alle. Det bestemte PFAS-stof vi har valgt kaldes PFOA og kan ses i figur 2. PFOA er en af de mest forekommende typer PFAS i miljøet, og derfor er netop denne PFAS særligt interessant at måle. Tanken er, at målingen af PFOA med FlouroLoop, skal fungere lidt ligesom hjemmetesten for covid-19. Denne test muliggjorde selvtest for Covid-19 ved at have en simpel procedure for opsamling af testmateriale samt et let aflæseligt resultat. Ved at indføre en simpel hjemmetest til måling af PFOA, vil det således være muligt for alle at se, om drikkevand indeholder PFOA over den tilladte grænseværdi. Og hvordan laver man sådan en test?

Rød er lig PFOA

Forestil dig, at du gerne vil teste om det vand, du skal til at drikke, indeholder PFOA over den tilladte grænseværdi. Med FluoroLoop skal du blot tilsætte vandet til et lille plastikrør, hvorefter prøven bliver synligt rød, hvis vandet indeholder PFOA over grænseværdien på 2 nanogram per liter! Du vil altså med det blotte øje kunne se, at vandprøven indeholder for høje PFOA-koncentrationer. Men hvordan virker det?

Vi har lavet et system, hvor kun tilstedeværelsen af PFOA resulterer i, at et protein med en rød farve bliver produceret. Den røde farve stammer fra proteinet mCherry. Når PFOA ikke er til stede, vil produktionen af mCherry være blokeret. Denne blokering mindskes gradvist, når mængden af PFOA i prøven øges, og dermed vil farven blive mere rød, jo mere PFOA-prøven indeholder. Lidt ligesom en pH-test som du måske har prøvet. Hvordan virker denne blokering, og hvorfor mindskes den af PFOA?

Helt nede på DNA-niveau

Du husker måske det centrale dogme, hvor den genetiske information i DNA’et først bliver transskriberet til mRNA for derefter at blive oversat (translateret) til proteiner, ellers kan du læse mere her. Forestil dig, at mRNA’et, der koder for vores røde protein, er togskinner. Toget er ribosomet, som sørger for at translatere mRNA’et til det røde protein. Hvis der ligger en blokering på togskinnerne, stopper togtrafikken. På samme måde er ribosomet nødt til at binde til mRNA’et for at kunne translatere mCherry. Når denne binding er blokeret, kan translationen ikke forløbe.

I vores system blokerer vi derfor det stykke på mRNA-molekylet hvor ribosomet binder. Blokeringen finder sted med et smart sensormolekyle, som kun binder til mRNA’et hvis der ikke er PFOA til stede i prøven. Vi sørger med dette sensormolekyle for at mCherry ikke produceres, så længe det er sensormolekylet bundet til mRNA’et. Vi kan forestille os, at togskinnerne er blokeret, og togtrafikken er stoppet. Men når blokeringen er væk, kører togdriften igen som normalt. På samme måde kan ribosomet genoptage translationen og dermed produktionen af vores røde protein, når sensor molekylet ikke er bundet. To forskellige vandprøver er vist i figur 5, hvor den ene indeholder PFAS (PFOA) og den anden ikke gør. Tilstedeværelsen af PFAS sørger for at fjerne blokeringen, og translationen forløber, så prøven bliver rød.

Figur 5: Forskellige vandprøver: PFAS er ikke til stede i vandprøve (A), men PFAS er til stede i vandprøve (B). (A) mRNA er blokeret, og dermed kan translationen af det røde protein, mCherry, ikke forløbe. Prøven bliver således ikke rød. (B) PFAS er til stede i vandprøven og binder til blokeringen (”STOP”). Dette tillader ribosom binding, og translationen af mCherry forløber. Derved bliver vandprøven rød. Figuren er lavet med Biorender. Stop Sign under licensen  CC BY 2.0.

Hovedparten iGEM projektet består i at udvikle sensormolekylet, som reagerer på PFOA. Til dette har vi har brugt redskaber kendt fra syntetisk biologi. Næste afsnit handler om hvordan vi har opnået dette.

PFOA-detektiven E. coli

For at lave vores biosensor har vi konstrueret to stykker cirkulært DNA. Disse cirkulære DNA molekyler kaldes plasmider. Plasmider benyttes særligt af bakterier til at opbevare ekstra genetisk materiale. Vi bruger bakterien E. coli, som er en almindelig tarmbakterie, til at producere vores to plasmider. Læs mere om plasmider og bakterier som cellefabrikker her. De to plasmider indeholder hhv. generne, der koder for mCherry og generne, der koder for sensoren (markeret i figuren som ”STOP”). De to plasmider er vist i figur 6.

Sensoren, som skal blokere for translationen af mCherry, kaldes en ”tRNA-mimicking structure” eller TMS. Dette molekyle indeholder to vigtige dele:

• En RNA-sekvens, som kan designes, så den binder til et sted på mRNA’et, så den blokerer for translationen af mCherry.
• En lille RNA-sekvens, kaldet en aptamer. Denne aptamer vil genkende og binde PFOA, når det er til stede.

Figur 6 rettes til: Figur 6: De to plasmider, som vores E. coli producerer. (A) viser plasmid 1, der indeholder generne for TMS’en. TMS’en består af aptamersekvensen, som kan genkende PFOA, og to områder A og B, som kan binde til områderne A og B på plasmid 2 vist i (B). Plasmid 2 indeholder desuden bindingsstedet for ribosomet RBS, og generne for det røde protein mCherry. Hvis translationen ikke bliver blokeret af TMS’en, vil proteinet mCherry blive produceret. Figuren er lavet med Biorender.

Du skal forestille dig, at TMS’en er lidt ligesom en hånd, der holder fast i mRNA’et, der hvor ribosomet binder. Men når PFOA binder til TMS’en tvinges den til at give slip på mRNA’et fordi den ændrer struktur. Det vil altså sige, at TMS’en ikke kan holde fast i mRNA’et, når PFOA er til stede. Når TMS’en slipper mRNA’et kan ribosomet producere vores røde gen, mCherry. Dermed bliver mCherry translateret, og vandprøven bliver rød.

På figur 7 ses denne udskiftning af mRNA til fordel for PFOA.

Figur 7: Bindingen mellem TMS’en og områderne A og B forhindrer ribosomet i at binde og dermed translatere og aktivere mCherry-genet. Når PFOA er til stede, vil molekylet binde til aptamersekvensen, hvilket resulterer i, at TMS’en ændrer struktur og ikke længere kan binde til områderne A og B. Dette frigiver området, hvor ribosomet er i stand til at binde (RBS), hvilket muliggør translation af mCherry. Resultatet af dette er en rød prøve. Figuren er tilpasset efter Paul et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 20328–20332.

Digitale detektiver: Hvordan computere kan bruges til at fange PFOA

Nu ved du egentlig det meste om hvad der er målet i iGEM projektet… Men hvordan laver man en smart TMS-sensor helt konret? Dette gøres ved brug af computerprogrammer som forklares i dette afsnit. Det er ret kompliceret, så du skal ikke blive bekymret, hvis du ikke forstår hver detalje.

For at biosensoren bliver sensitiv nok, skal TMS’en optimeres. Jo bedre TMS’en bliver til at binde til PFOA og dermed give slip på mCherry genet, jo bedre vil biosensoren være til at detektere PFOA. Denne form for optimering er tids- og ressourcekrævende, hvis den udelukkende udføres i laboratoriet. Her ville mange sekvenser skulle genereres og testes, indtil en tilfredsstillende binding til PFOA opnås. I stedet, kombineres laboratoriearbejdet med computer modeller. Arbejde med biologi med compuremodeller kalder vi for ”in silico” arbejde (opkaldt efter silicium chips i computeren)

Ved brug af forskellige redskaber, kan en computermodel undersøge om en aptamer sekvenser kan binde PFOA. Computeren skal altså ud fra nogle matematiske beregninger og visuelle 3D-strukturer undersøge hvilke sekvenser, der kunne være bedst til at binde PFOA. Når de bedste sekvenser er fundet, kan man derefter tage sekvenserne med i laboratoriet og undersøge disse nærmere.

Vores digitale detektiv består af fire forskellige programmer:

• MAWS (Making Aptamers without SELEX)
• 2D simulering af foldning
• Molekylær docking (molecular docking)
• Molekylærdynamik (molecular dynamics)

Det kan måske godt virke lidt uoverskueligt, hvad disse værktøjer dækker over, og hvad deres funktion er. Du kan klikke på nedenstående sektioner for at lære mere om, hvad de enkelte dele betyder, og hvordan de fungerer.

Opsummering

FluoroLoop er et projekt, der går ud på at bruge syntetisk biologi til at skabe en biosensor, som er i stand til at detektere PFOA i vandprøver. Vi vil samtidig forbedre sensorens sensitivitet ved brug af computerredskaber. Alt dette er vigtigt fordi vi ved, at PFOA (og generelt PFAS) kan være skadelig i meget små mængder. Men dette er bare starten!

Prøv at forestille dig, hvad vores sensor kan bruges til, hvis bare aptamer-sekvensen justeres til at måle andre molekyler end PFAS. Kan du forestille dig, hvilke andre sensorer der ville være smarte at have? Måske kan du også forestille dig nogle negative konsekvenser